Oligonucleotide là gì

     

Thuật ngữ PCR là viết tắt của "Polymerase-Chain-Reaction", đây là một phản bội ứng nhân bản DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt. Bài viết này nhằm giới thiệu các thông tin quan trọng đặc biệt về nghệ thuật PCR tương tự như các sự việc thường gặp gỡ khi thực hiện kỹ thuật này.Bạn đang xem: Oligonucleotide là gì

 

KỸ THUẬT PCR LÀ GÌ?

 

Thuật ngữ PCR duy nhất phản ứng nhân phiên bản DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt. Phản ứng diễn ra trong một ống nghiệm bé dại chứa dung dịch phản ứng (gọi là PCR mix). Vào PCR mix đã chứa các thành phần:

1) Polymerase sức chịu nóng (Taq polymerase), enzyme này có nhiệt độ chuyển động tối ưu nghỉ ngơi 72 oC.

Bạn đang xem: Oligonucleotide là gì

Bạn vẫn xem: Oligonucleotide là gì

2) 4 loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP là nguyên vật liệu để tổng hợp ra các bản sao DNA.3) DNA cất trình tự kim chỉ nam (Template): thông thường trong xét nghiệm thì đó là DNA thu thừa nhận từ mẫu nên xét nghiệm.4) Cặp mồi quánh hiệu (Primer): Đây là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng chừng 20 nucleotide cùng bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân bản.5) Cation Mg2+ (MgCl2): đó là co-factor đặc biệt để Taq polymerase hoạt động hiệu quả.6) hỗn hợp đệm Tris-KCl (PCR Buffer): hỗ trợ môi trường tiện lợi cho phản bội ứng nhân bạn dạng diễn ra.

 

Ống nghiệm cất PCR mix sẽ được đặt vào trong buồng ủ của dòng sản phẩm luân nhiệt độ (Thermo cycler), ở nước ta thì thường gọi luôn luôn là đồ vật PCR. Nhiệt độ bên trong buồng ủ của sản phẩm PCR sẽ thay đổi theo chu kỳ, nhờ đó mà quá trình nhân bạn dạng DNA được ra mắt (xem video).

 

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR

 

Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ tất cả 3 quá trình nhiệt độ (Hình 1):

1 - quy trình biến tính: nhiệt độ độ sẽ được đưa lên 94 oC, các liên kết hydro sẽ ảnh hưởng phá vỡ khiến cho DNA bị đổi mới tính trở nên dạng mạch đơn.

Xem thêm: " Native Language Là Gì ?, Từ Điển Anh Định Nghĩa, Ví Dụ, Giải Thích

2 - quá trình bắt cặp: nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65 oC, các đoạn mồi vẫn bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.3 - quy trình tiến độ kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dãn dài đầu 3" của mồi và tạo thành mạch xẻ sung.
*

Hình 1. Chu trình nhiệt của một tiến trình PCR

Như vậy, cứ sang 1 chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi. Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại liên tiếp 30 - 40 lần thì số phiên bản sao sẽ là 230 ~ 240 bản sao. Số lượng bản sao DNA vĩ đại này khi được gắn các phân tử phát tín hiệu (ví dụ Ethidium Bromide) rất có thể nhìn thấy bằng mắt hay trên gel điện di dưới ánh sáng của đèn UV (Hình 2).

1527453158292/Agarose-gel-electrophoresis-analysis-stained-with-ethidium-bromide-of-PCR-products.png" alt="*">Hình 2. Ảnh chụp thành phầm PCR (giếng 1~7) dưới ánh đèn UVtrên gel agarose nhuộm bởi Ethidium Bromide

 

VẤN ĐỀ NGOẠI NHIỄM SẢN PHẨM PCR

 

Nguyên lý của PCR là khuếch tán DNA, bởi vậy các phòng thí nghiệm thực hiện PCR liên tục không sớm thì muộn cũng trở nên bị nhiễm sản phẩm PCR lên tất cả các thiết bị, dụng cụ, hóa chất. Bạn làm nghiên cứu sẽ nhận biết được thảm họa này khi toàn cục các lần chạy PCR đều ra dương tính, của cả khi áp dụng mẫu là nước cất. Khi điều này xảy ra thì chỉ có cách bỏ toàn cục hóa chất, khử nhiễm toàn cục phòng xem sét .... Cho dù vậy điều đó vẫn vẫn tái diễn sau đó 1 khoảng thời gian sử dụng PCR.


*

Hình 3. Sơ thứ xử lý thành phầm PCR nước ngoài nhiễm bằng UNG

Nhiễm thành phầm PCR từng là thách thức so với các phòng thí điểm sinh học phân tử. Tuy nhiên, bây giờ các nhà khoa học đã hoàn toàn có thể giải quyết vụ việc này một phương pháp khá bổ ích (Hình 3), đó là trong yếu tắc dNTP có bổ sung cập nhật thêm một không nhiều dUTP. Các sản phẩm PCR tạo thành sẽ luôn luôn tồn tại một số vị trí là U thay vì chưng T, các vị trí U này sẽ có thể xử lý phân hủy bởi enzme UNG. Mẫu mã DNA thu nhận từ chủng loại thật (template) sẽ không chứa U, vị vậy ủ PCR set với enzyme UNG trước khi PCR sẽ giúp đỡ phân cắt toàn thể các DNA nước ngoài nhiễm nhưng không ảnh hưởng đến template.

 

CÁC KỸ THUẬT PCR THƯỜNG GẶP trong XÉT NGHIỆM

 

1) PCR 1-1 mồi (Simplex PCR): Đây là đẳng cấp PCR truyền thống nhất, thực hiện 1 cặp mồi quánh hiệu để khuếch đại 1 đoạn trình tự phương châm duy nhất.

2) PCR đa mồi (Multiplex PCR): Đây là đẳng cấp PCR áp dụng nhiều cặp mồi không giống nhau để khuếch đại những trình tự mục tiêu khác nhau trong cùng 1 mix làm phản ứng. Để xây cất được bội nghịch ứng Multiplex PCR yên cầu các cặp mồi áp dụng phải gồm cùng ánh nắng mặt trời bắt cặp và các cặp mồi này cũng ko được bắt cặp cùng với nhau tuyệt bắt cặp chéo lẫn nhau. Ngoài ra, cũng phải đảm bảo an toàn độ tinh tế Multiplex PCR tương tự với Simplex PCR, vấn đề đó rất khó xảy ra nên thường thì multiplex PCR được sử dụng ở các tế bào nuôi cấy vì hôm nay số lượng trình tự đích đủ lớn sẽ không yên cầu quá nghiêm ngặt về độ nhạy.

Xem thêm: Tại Sao Sử Dụng Máy Massage Bụng Bị Ngứa Là Do Đâu? Tại Sao Sử Dụng Máy Massage Bụng Bị Ngứa


*

Hình 4. Sơ trang bị một quy trình Nested PCR

3) PCR tổ (Nested PCR): áp dụng 2 cặp mồi, cặp mồi bên phía ngoài (outer primer) và cặp mồi phía bên trong (nested primer). Cặp mồi bên phía ngoài sẽ thâm nhập PCR lần 1 trước để làm tăng số lượng DNA chứa trình từ đích, tiếp theo là cặp mồi bên trong sẽ thâm nhập PCR lần 2 để phát hiện nay trình từ đích (Hình 4). Chuyên môn này sử dụng khi cặp mồi sệt hiệu mang đến trình trường đoản cú đích (nested primer) gồm độ tinh tế kém.

4) RT-PCR: Là quy trình sử dụng khi trình từ đích là RNA, lúc này cần một bước sử dụng enzyme reverse transcriptase để đưa RNA thành cDNA trước lúc PCR, tiến độ này điện thoại tư vấn là quy trình RT. Kỹ thuật RT-PCR tất cả 2 một số loại (Hình 5):